血管功能對癡呆和阿爾茲海默癥的作用逐漸被人們重視。最近研究表明，血腦屏障（blood–brain barrier, BBB）破壞是認知功能障礙的早期生物標志物，包括阿爾茨海默病的臨床前期。APOE4是阿爾茨海默病的主要易感基因，會導致BBB破壞加速和腦內毛細血管中的周細胞變異。然而，目前尚不清楚APOE4對血管的作用是否會進而導致認知功能障礙。在本研究中，我們發現：APOE4攜帶者（具有ε3/ε4或ε4/ε4等位基因）與APOE4非攜帶者之間的區別在于在海馬和顳葉內側的BBB破壞，而且這種區別在存在認知功能障礙的APOE4攜帶者中更為明顯，但是BBB破壞與淀粉樣蛋白（Aβ）或tau蛋白病理無關。腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中周細胞損傷標志物PDGFRβ高水平可預測APOE4攜帶者的認知功能下降。但這種關系與Aβ和tau病理無關，而與CypA-MMP9信號通路有關。我們的研究結果提示BBB破壞導致APOE4相關認知功能下降，而與阿爾茨海默病的病理學無關，并且這可能是APOE4攜帶者的治療靶點。本文發表在Nature雜志。(可添加微信號siyingyxf或18983979082獲取原文，另思影提供免費文獻下載服務，如需要也可添加此微信號入群，原文也會在群里發布)。 溫故而知新，建議結合以下相關解讀閱讀（直接點擊，即可瀏覽，加微信號siyingyxf或18983979082獲取原文及補充材料）：
癡呆患者血腦屏障(Blood-Brain Barrier, BBB)功能測量
研究方法研究參與者：
研究受試者來自三個地方：南加州大學(USC)、華盛頓大學（WashU）、Banner阿爾茨海默氏癥協會。所有參與者(n = 435)均接受神經影像檢查和神經心理學評估。使用統一的數據采集流程和神經心理學測試。收集靜脈血檢查血液標志物。350（81%）位受試者行腰穿采集CSF。245名參與者(56%)采集DCE-MRI以評估BBB通透性。共172例受試者都進行了腰穿和DCE-MRI檢查。在245例采集DCE-MRI的參與者中，分別對74例和96例進行了Aβ和tau特異性的PET掃描。
參與者入選和排除標準：
入選的參與者（≥45歲）通過認知評估確認目前認知功能正�；蛱幱�AD的最早癥狀階段。排除可能影響認知功能評估的任何神經或精神疾病，例如器官衰竭、腦腫瘤、癲癇、腦積水、精神分裂癥和重度抑郁癥等。參與者按APOE基因型分層，分為APOE4攜帶者（ε3/ε4和ε4/ε4）或APOE 4非攜帶者（ε3/ε3），也定義為APOE 3純合子。根據CDR評分和基于綜合神經心理學評價（包括評估記憶、注意力/執行功能、語言和整體認知等十項神經心理學測試的表現）的一個或多個認知領域中存在認知障礙明確受試者是否認知正�；虼嬖谳p度認知功能障礙。在統計分析中，具有ε3/ε4和ε4/ε4等位基因的個體被合并在一個APOE 4攜帶組，目前在本隊列中沒有發現具有兩個與一個ε4等位基因的個體之間（82-86%的ε3/ε4和14-18%的ε4/ε4受試者）的研究參數存在顯著差異，包括評估BBB的Ktrans常數和CSF中sPDGFRβ水平。根據CSF的Aβ和pTau 分析，使用可接受的臨界值，將參與者進一步分層為Aβ1-42 +（<190 pg/ml）或Aβ1-42
參與者入選和排除標準：
入選的參與者（≥45歲）通過認知評估確認目前認知功能正�；蛱幱�AD的最早癥狀階段。排除可能影響認知功能評估的任何神經或精神疾病，例如器官衰竭、腦腫瘤、癲癇、腦積水、精神分裂癥和重度抑郁癥等。參與者按APOE基因型分層，分為APOE4攜帶者（ε3/ε4和ε4/ε4）或APOE 4非攜帶者（ε3/ε3），也定義為APOE 3純合子。根據CDR評分和基于綜合神經心理學評價（包括評估記憶、注意力/執行功能、語言和整體認知等十項神經心理學測試的表現）的一個或多個認知領域中存在認知障礙明確受試者是否認知正�；虼嬖谳p度認知功能障礙。在統計分析中，具有ε3/ε4和ε4/ε4等位基因的個體被合并在一個APOE 4攜帶組，目前在本隊列中沒有發現具有兩個與一個ε4等位基因的個體之間（82-86%的ε3/ε4和14-18%的ε4/ε4受試者）的研究參數存在顯著差異，包括評估BBB的Ktrans常數和CSF中sPDGFRβ水平。根據CSF的Aβ和pTau 分析，使用可接受的臨界值，將參與者進一步分層為Aβ1-42 +（<190 pg/ml）或Aβ1-42 −（>190pg/ml），以及pTau+（>78 pg/ml）或pTau−（<78 pg/ml）。
如果受試者被診斷為血管性認知障礙或血管性癡呆，則將其排除。臨床診斷由神經科醫生做出，標準包括患者是否患有已知的血管性腦損傷，以及臨床醫生是否判斷血管性腦損傷在其認知障礙和/或癥狀模式和病程中發揮作用。除臨床診斷外，血管病變的存在還可通過液體衰減反轉恢復（FLAIR）序列所示中度至重度腦白質病變和腔隙性梗死和/或T2*加權成像顯示的皮質下微出血來證實。如果參與者被診斷為帕金森病、路易體癡呆或額顳葉癡呆，他們也被排除在外。單次卒中或短暫性腦缺血發作病史不排除，除非其與認知損害癥狀性發作相關。參與者目前也沒有MRI禁忌癥，目前也沒有使用可能更好地解釋任何觀察到的認知障礙的藥物。
臨床檢查：
根據所有研究中心統一制定的數據采集流程對參與者進行臨床評估，包括對受試者和受試者家屬進行臨床訪談和審查認知癥狀和既往疾病史。對受試者進行一般體格檢查和神經系統檢查。CDR評估按照已發布的標準化程序進行。根據認知功能障礙和AD的認知和生物學研究標準的當前診斷模型，使用CSF的Aβ1-42和pTau的既定臨界值，根據認知功能障礙和AD生物標志物異常對受試者進行單獨分層。認知障礙是根據總體CDR評分和一個或多個認知域障礙而確定的。
血管性危險因素：
通過體格檢查、血液檢查和與參與者和知情者的臨床訪談評估每個參與者的血管危險因素（VRF）負擔，調查包括心血管疾病史（心力衰竭、心絞痛、支架放置、冠狀動脈旁路移植、間歇性跛行）、高血壓、高脂血癥、2型糖尿病、心房纖維性顫動和短暫性局部缺血發作或輕微中風。如前所述，VRF總負擔定義為這些風險因素的總和。我們認為有兩個或多個VRF的個體VRF負荷較高。采用該閾值是因為先前的研究表明，老年AD患者尸檢時存在兩個或多個VRF與隱匿性腦血管疾病相關，而單個VRF常見，不一定與該人群腦血管疾病增加相關。
認知域損傷評估：
使用先前描述的認知障礙的神經心理學標準，通過綜合神經心理學測試的表現來判斷一個或多個認知領域的障礙。所有參與者均接受神經心理學測試，包括UDS組合（版本2.0或3.0）以及每個研究中心的補充神經心理學測試。使用國家阿爾茨海默病協調中心（NACC）基于回歸的標準化程序，評價了10項神經心理學測試的標準化z評分，以確定認知域損傷，包括每個認知領域（記憶、注意力/執行功能和語言）的3項測試和1項整體認知測試。使用先前描述的神經心理學標準確定一個或多個認知域的損害，并定義為評分>1s.d.。在單個認知領域內的兩次或多次測試或跨認知領域的三次或多次測試中低于正常參考值。先前的研究已經確定了這些標準相對于采用單一測試分數的標準的改進的靈敏度和特異性，以及這種診斷方法對各種神經心理電池的適應性。如果參與者的完整神經心理學測試數據少于90%，則將其從認知領域分析中排除（MRI、PET和CSF分析分別排除53、24和82名參與者）。根據他們有兩個或多個受損測試分數的認知域的數量，將納入的參與者分為0、1或2+組。
每個UDS版本和招募研究中心的成套檢測詳情如下：
i）整體認知功能：MMSE適用于UDS版本2，莫卡適用于UDS版本3。
ii）記憶：UDS版本2的The Logical Memory Story A Immediate and Delayed free recall tests(modified from the original Wechsler Memory Scales, Third Edition (WMS-III))和UDS版本3的Craft StoriesImmediate and Delayed free recall。對于補充測試，南加州大學的參與者額外進行了theCalifornia Verbal Learning Test, Second Edition (CVLT-II) and the SelectiveReminding Test (SRT) sum of free recall trials. Norm-referenced scores forthese supplementary test scores were derived from a nationally representativesample published with the test manual (CVLT-II)40 and in studies of normallyageing adults (SRT)。這些補充測試分數的正常參考分數來自測試手冊（CVLT-II）中公布的全國代表性樣本和正常老年人研究。
Iii）注意力和執行功能：UDS第2版的The Trails A, Trails B, and Wechsler Adult Intelligence Scale—Revised (WAIS-R) Digit Span Backwards tests for UDS version 2和UDS第3版的 the TrailsA, Trails B and Digit Span Backwards tests。
iv）語言：UDS第2版的The Animal Fluency, Vegetable Fluency, and Boston Naming Tests和UDS第3版的AnimalFluency, Vegetable Fluency, and Multilingual Naming Test (MINT)。
磁共振成像和分析：
MRI數據是在南加州大學Mark和Mary Stevens神經成像和信息學研究所和圣路易斯華盛頓大學獲得的。我們開發了一個標準化的高分辨率3T MRI掃描方案。在USC研究中心，使用Siemens 3T Prisma掃描儀和32通道頭部接收線圈和身體發射線圈。在WashU研究中心，使用了配備20通道頭部線圈的Siemens 3T mMR和配備64通道頭部線圈的Siemens 3T Vida。首先通過海馬獲得解剖冠狀面自旋回波T2加權掃描（TR/TE 8020/50 ms，NEX = 1，層厚2 mm，層間間隙2 mm，FOV =175 × 175 mm，矩陣大小= 448 × 448）。然后使用T1加權3D容積內插屏氣（VIBE）序列和可變翻轉角方法（翻轉角為2 °、5 °、10 °、12 °和15 °）采集基線冠狀T1加權圖。使用T1加權3D volumetric interpolated breath-hold (VIBE) 序列采集覆蓋海馬和顳葉的冠狀DCE-MRI（FA = 15°，TR/TE= 5.14/2.18 ms，NEX = 1，層厚5 mm，無間隙，FOV 175 × 175 mm，矩陣大小320 × 320，體素大小0.550 × 0.550 × 5 mm 3）。重復該序列共16分鐘，時間分辨率約為15.4秒。在DCE開始掃描前30秒，使用高壓注射器將釓基造影劑（GBCA）釓特酸葡甲胺（多它靈，加栢，法國）（0.05 mmol/kg）靜脈注射至肘前靜脈，速率為3 ml/s，然后用25 ml生理鹽水沖洗。
MRI方案的標準化和優化需要在體模上執行幾項測試。具體而言，實施、優化和應用了掃描儀表征和校準序列，包括B0、T1和可變翻轉角映射。在質量控制和可重復性方面取得良好結果后，我們在USC和WashU研究中心標準化并采用相同的造影前和動態T1加權成像。值得注意的是，兩臺掃描儀上的所有其他MR序列也相同。
為了最大限度地減少研究中心之間的變異性，所有MRI方案（包括解剖和DCE脈沖序列）從一個研究中心100%鏡像到另一個研究中心，并以相同濃度（0.05 mmol/kg）向受試者注射相同造影劑釓特酸葡甲胺。最后，兩個研究中心均采用完全相同的預處理和后處理分析流程，包括使用線性擬合的T1 multi-FA映射和使用每個個體頸內動脈確定的動脈輸入函數的基于Patlak的DCE建模。
我們之前的研究進一步證實了兩個研究中心結果的一致性。簡而言之，我們對USC和WashU研究中心的合并DCE數據集進行了分析，并對兩個研究中心分別進行了研究中心特異性分析，結果顯示研究中心之間無統計學顯著差異。最近，我們邀請了52名參與者在首次DCE-MRI 后進行額外的無造影劑T1加權掃描（使用相同的掃描儀和相同的MR脈沖序列），并以兩年為間隔測量B 0和T1值。本研究表明，掃描結果未發生變化且一致，支持研究中心內變異性極小。
BBB通透性定量：
為了解釋血流對DCE-MRI測量的可能混雜效應，我們在每個研究個體中確定來自頸內動脈（ICA）的動脈輸入函數（AIF）曲線，其提供靜脈注射后動脈血中釓示蹤劑濃度的動態分布，而不是使用來自上矢狀靜脈竇的平均值來確定血液中的示蹤劑濃度。盡管不如同時測量相同受試者的血流那樣理想，但是使用動脈血中示蹤劑濃度的單獨AIF動態分布測量自校正可能影響示蹤劑經由流過ICA向大腦遞送的血流中的可能差異，這有助于最大限度地減少血容量和血流量變化的可能混雜效應，這些效應可能會影響Ktrans的測量。從位于ICA的感興趣區（ROI）提取的AIF在與Patlak模型擬合之前與雙指數函數擬合。在少數情況下，當ICA不清晰可見時，使用附近的大動脈血管作為替代。
Patlak線性回歸分析用于生成BBB滲透率的Ktrans圖，如我們之前所報告的。高時空分辨率不僅允許同時測量不同白質和灰質區域中的局部BBB通透性，而且允許精確計算像皮質灰質區域一樣薄的小解剖區域中的Ktrans值。
本研究要求在采集時間內示蹤劑在BBB上的擴散保持單向。組織中的總示蹤劑濃度Ctissue（t）可被描述為血液濃度CAIF（t）、血管內血容量Vp和血液到腦轉移常數Ktrans的函數，該常數表示使用以下方程從血管內到血管外細胞外空間的流量：
我們沒有觀察到vp測量值的受試者之間顯著的統計學差異。例如，HC的vp（平均值±SEM）為0.0166 ± 0.0003（n=128;CDR0 APOE4）為0.0167 ± 0.0005（n=68;CDR0 APOE4），0.0183 ± 0.0009（n=14;CDR0.5APOE3）和0.0164 ± 0.0009（n=25;CDR0.5 APOE4）。在PHG，vp為0.0172 ± 0.0003（n=128;CDR 0 APOE3）為0.0171 ± 0.0004（n=68;CDR 0 APOE4），0.0180 ± 0.0009（n=14;CDR0.5 APOE3）和0.0180 ± 0.0008（n=25;CDR 0.5 APOE4）。DCE-MRI輸出圖的基于ROI的分析由經驗豐富的神經放射科醫生執行，該醫生根據每位參與者的解剖結構在T1加權（FA 12°）對比前MR圖像上手動繪制ROI，以最大限度地減少個體之間的差異，如在宏觀水平上所見（例如，腦室擴大、皮質萎縮、海馬萎縮）。因此，在10個不同的灰質和白質ROI中測量局部BBB的Ktrans值，包括：包括海馬（HC）、海馬旁回（PHG）、尾狀核、丘腦、紋狀體、眶額皮質、顳下回、皮質下分水嶺白質纖維、胼胝體和內囊。
定量評估局部腦體積：
HC和PHG形態測定使用使用FreeSurfer（v5.3.0）軟件包。使用FreeSurfer Desikan-Killiany和皮質下圖譜分割HC和PHG。然后，相應地推導出局部體積（mm 3）。該程序的技術細節已在前面描述過。數據處理和可視化使用神經成像實驗室（LONI）管道系統（http：pipeline.loni.usc.edu）和定量成像工具包進行。
PET掃描和分析
在USC分子成像中心或WashUMallinckrodt放射學研究所進行PET圖像采集和數據分析。分別使用118 F-florbetaben (FBB) 或 18 F-florbetapir (FBP) 和18 F-flortaucipir(AV1451)進行Aβ和tau PET研究。對于所有Aβ PET分析，合并FBP和FBB數據集。在USC研究中心使用Siemens Biograph 64 PET掃描儀。在WashU研究中心，在Siemens mMR上采集FBP掃描，在Siemens Biograph mCT上采集AV 1451掃描。mCT會話用于mMR掃描的衰減校正。受試者注射300 MBq（±10%）FBB或370 MBq（±10%）FBP。分別在注射后90至110分鐘和50至70分鐘采集FBB和FBP圖像。參與Aβ和tau PET研究的受試者也分別在Aβ和tau PET掃描后2.2 ± 0.9和2.1 ± 0.6個月內進行了DCE-MRI掃描。
簡而言之，在每次PET成像之前，首先進行計算機斷層掃描（CT）以進行衰減校正。使用標準攝取值圖（SUV，g/ml）處理從FBB、FBP和AV 1451示蹤劑下載的PET圖像。使用FSL-FLIRT（FMRIB的線性圖像配準工具）將所有PET圖像與結構高分辨率3D T1加權Magnetization Prepared RapidAcquisition Gradient Echo (MP-RAGE) MRI圖像配準。FreeSurfer分割的小腦被用作參照組織，以使Aβ和tau蛋白標準化。
將PET圖像配準到解剖參考圖像（MNI152標準空間）中后，使用SPM12在體素水平進行組間比較。在多元回歸模型中引入PET成像時的年齡、性別和教育作為協變量。Aβ的顯著性水平設定為P<0.001，tau蛋白的顯著性水平設定為P<0.005（未校正P值），聚類中的最小體素數（Ke）為50。
此外，鑒于已知AV 1451脫靶配體在脈絡叢（Choroid plexus，CP）中的結合，由于CP與HC的緊密接近和PET掃描的相對低的空間分辨率，其可有助于HC區域AV 1451信號（即體素大小約為6 mm），我們利用DCE-MRI可視化CP，也在這些個體中進行，這使我們能夠減去CP信號對HC AV 1451固有信號的貢獻。使用以下步驟校正脫靶配體與CP的結合（見擴展數據圖5）。步驟1：從3D T1加權MP-RAGE生成HC掩模。第2步：根據GBCA后的T1加權VIBE（FA = 15°）圖像生成CP蒙片。第3步：重疊HC和CP Mask。第4步：在DCE數據生成的CP蒙片頂部添加6 mm體素尺寸后，減去CP和HC蒙片的重疊部分，以獲得CP校正的HC PET信號。應用CP校正前后HC AV 1451 PET信號的代表性圖像如擴展數據圖5所示。
我們接下來對所有按APOE基因型分層的參與者中Aβ和tau蛋白SUV比值（SUVR）的局部變化與局部DCE-MRI的Ktrans常數的關系進行量化。區域SUVR值取自FreeSurfer分段HC、PHG、OFC 28和ITG。測定所有受試者的BBB的 Ktrans常數（擴展數據表2a、b）。這包括同時分析淀粉樣蛋白和tau蛋白（n = 58）、僅分析淀粉樣蛋白（n = 9）或僅分析tau蛋白（n = 29）的患者。
APOE基因型：
使用Quick-gDNA血液微量制備試劑盒（目錄號D3024，Zymo Research，Irvine，CA）從血沉中提取DNA。APOE基因分型通過基于聚合酶鏈反應（PCR）的保留片段長度多態性分析進行，如先前報道。
分子檢測：
檢測CSF中sPDGFRβ水平。檢測BBB破壞標志物，包括白蛋白商、CSF中纖維蛋白原和纖溶酶原水平。檢測CypA和MMP9水平。以及，檢測神經膠質細胞損傷、炎癥、Aβ、Tau等水平。
iPSC細胞和誘導分化周細胞：
iPSC細胞系是通過對患有AD或未患有AD（對照）的APOE ε4/ε4和APOE ε3/ε3供體的皮膚成纖維細胞進行重編程而產生的。如前所述進行iPSC向周細胞的分化。
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上海：
第二十九屆擴散成像數據處理班（上海，2.11-16）
第十四屆任務態功能磁共振數據處理班（上海，2.22-27）
第七十七屆磁共振腦影像基礎班（上海，3.3-8）
第七屆影像組學班（上海，3.21-26）
北京：
第三十四屆磁共振腦網絡數據處理班（北京，2.9-14）
第七十五屆磁共振腦影像基礎班（北京，2.23-28）
第三十屆擴散成像數據處理班（北京，3.3-8）
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研究結果
拓展表1. 通過DCE-MRI研究APOE 3和APOE4攜帶者的局部BBB通透性變化的245名受試者信息
通過動態對比增強磁共振成像（DCE-MRI）分析血腦屏障通透性（圖1a）表明，在245參與者中（拓展表1），與認知正常的APOE3純合子（ε 3/ε 3）相比，認知正常（臨床癡呆評分[CDR]評分為0）的APOE4（ε 3/ε 4和ε 4/ε 4）攜帶者的海馬（HC）和海馬旁回（PHG）中BBB破壞增加。在認知功能障礙的APOE4攜帶者（CDR評分為0.5）中，HC和PHG區的BBB破壞程度進一步增加（圖1b-d）。這種APOE4相關的BBB破壞與腦脊液（CSF）中β淀粉樣蛋白（Aβ）和磷酸化tau蛋白（pTau）無關（圖1 e-h）;這意味著，這可能是一種獨立于Aβ和Tau這兩種經典AD相關通路的全新機制。相比之下，認知障礙的APOE 3攜帶者在HC和PHG中發生的BBB破壞不太明顯（圖1b-d）。此外，研究發現除了尾狀核中BBB通透性輕微增加，額葉皮質和胼胝體中有輕微的BBB滲漏（擴展數據圖1），APOE4攜帶者和APOE3純合子在其他灰質或白質腦區沒有顯著的BBB功能的差異。當通過神經心理學表現評估不同認知域功能障礙時，這些發現仍然成立（擴展數據圖2,3）。
在APOE4攜帶者中，HC和PHG的體積隨著認知障礙而減少，但在APOE 3攜帶者中，HC和PHG的體積沒有減少（圖1 i-k）。在我們對年齡、性別、教育程度、CSF重Aβ和pTau狀態以及HC和PHG體積進行統計學控制后，APOE4攜帶者（而非APOE 3純合子）HC和PHG中BBB破壞仍然是認知障礙的重要預測因素（圖1 l，m）。我們發現BBB功能障礙（圖1c、d、l、m）先于腦萎縮（圖1 j、k），而與其他的血管性風險因素無關（拓展數據圖4）。
圖1. 在APOE4攜帶者中，HC和PHG中的BBB破壞隨認知障礙增加而增加，與CSF中Aβ和tau狀態無關。其中，a和b為DCE-MRI產生的BBB滲透性轉移常數（Ktrans）圖，i為HC（海馬，藍色）和PHG（海馬旁回，黃色）覆蓋在3D模板上的位置。
拓展圖1.在認知功能正常和障礙的APOE4攜帶者和非攜帶者（APOE3）中，另外8個腦區的局部BBB的 Ktrans系數比較。
在認知功能正常和障礙的APOE4攜帶者和非攜帶者（APOE3）中，顳下回（ITG，a）、上額葉（SFG，b）、尾狀核（CN，c）、丘腦（Thal，d）、紋狀體（Str，e）、皮質下分水嶺區正常外觀的腦白質（Subcort.WS NAWM，f）、胼胝體（CC，g）和內囊（IC，h）的BBB的 Ktrans系數比較。
拓展圖2. 在APOE4攜帶者中，HC和PHG中BBB破壞隨認知域損害而增加。在具有不同程度的認知域障礙的APOE4攜帶者和APOE3攜帶者中，HC和PHG的BBB的 Ktrans系數比較。
拓展圖3. 當APOE4攜帶者和APOE3攜帶者具有不同程度的認知功能障礙時，另外8個腦區的局部BBB的 Ktrans系數在具有不同程度的認知域障礙的APOE4攜帶者和APOE3攜帶者中，顳下回（ITG，a）、上額葉（SFG，b）、尾狀核（CN，c）、丘腦（Thal，d）、紋狀體（Str，e）、皮質下分水嶺區正常外觀的腦白質（Subcort.WS NAWM，f）、胼胝體（CC，g）和內囊（IC，h）的BBB的 Ktrans系數比較。
拓展圖4. APOE4攜帶者和APOE3攜帶者所有研究腦區的局部BBB的Ktrans常數與血管危險因素（VRF）的關系
拓展表2.通過PET研究APOE 3和APOE 4攜帶者的局部淀粉樣蛋白或tau腦蓄積和通過DCE-MRI研究BBB滲透性變化的74名受試者信息
由于Aβ和tau均可導致血管功能異常和BBB破壞，因此我們分別在包含了74例和96例受試者的亞組中研究了APOE4攜帶者的BBB破壞是否在Aβ和tau沉積的下游（擴展數據表2a，b）。正電子發射斷層掃描（PET）分析表明，與APOE 3純合子相比，認知正常的APOE 4攜帶者眶額皮質（OFC）中Aβ沉積更明顯。為了確定BBB通透性與Aβ和tau蛋白積聚的關系，我們選擇了5毫米厚的包括HC和PHG、OFC（APOE 4攜帶者首先發生Aβ沉積的部位）和顳下回（ITG；早期受tau病理影響的區域）在內的冠狀切片。結果表明，盡管與小腦相比，HC中的Aβ和tau蛋白明顯增加，但是APOE4和APOE3攜帶者之間在HC中的Aβ和tau蛋白沉積無明顯差異（圖2a，b）。與APOE 3純合子相比，APOE 4攜帶者HC中的BBB受到破壞（圖2c），這與我們之前在更大隊列中（n=245）的發現一致（圖1b，c）。盡管APOE4攜帶者存在PHG區域的BBB破壞，但是APOE4和APOE3攜帶者之間在PHG中的Aβ和tau蛋白沉積無明顯差異（圖2d–f）。認知功能正常的APOE 4攜帶者PFC中Aβ沉積顯著高于APOE 3攜帶者（圖2g，h），但BBB完整性沒有差異（圖2g，i）。在ITG中，APOE 4和APOE 3攜帶者之間的tau沉積或BBB完整性無顯著差異（圖2j-1）�？傊�，這些數據表明APOE 4攜帶者HC和PHG中的BBB破壞與AD病理無關，并且APOE 4攜帶者中的BBB破壞始于內側顳葉（負責記憶編碼和其他認知功能）。 
圖2. APOE4攜帶者血腦屏障的破壞與腦中Aβ和tau蛋白的積累無關。所有研究均在CDR評分0的個體中進行。
拓展圖5. APOE 4攜帶者的Aβ和tau 的PET分析
在AD患者和動物模型中，CSF中可溶性血小板衍生生長因子受體-β（sPDGFRβ）水平升高提示周細胞損傷與BBB破壞和認知功能障礙相關。使用中位數分割直觀顯示350例受試者的CSF sPDGFRβ基線水平（拓展表3），我們將所有受試者分為兩組：低CSF sPDGFRβ水平組（0-600 ng/ml）和高CSF sPDGFRβ水平組（600-2000 ng/ml）（圖3a）。在146例APOE4和APOE3攜帶者中，均從基線起間隔2-4.5年進行了認知功能檢查。基線CSF中sPDGFR β較高的受試者在總體精神狀態檢查和總體認知復合z評分方面表現出加速的認知下降，在控制CSF中A β和tau狀態后仍具有顯著性（圖3b，c）。當按APOE狀態分層分析時發現，基線CSF中sPDGFR β水平可以預測APOE4攜帶者的認知下降（圖3d，e），但不能預測APOE3攜帶者的認知功能下降（圖3f，g）。拓展表3. 研究APOE3和APOE4攜帶者的CSF中sPDGFRβ水平的350名受試者信息
圖3.基線CSF中sPDGFRβ水平升高可預測APOE4攜帶者的認知功能下降
CSF中sPDGFRβ水平增加與APOE4攜帶者的認知功能下降的相關性也同樣發現與橫斷面分析中 (圖4 a, b)。CSF中sPDGFRβ水平升高也與APOE4攜帶者的HC和PHG的 BBB通透性的增加有關(圖4 c, d)。CSF中sPDGFRβ水平升高也與BBB破壞的分子生物標志物水平升高有關，包括CSF/血漿的白蛋白商值、CSF纖維蛋白原和纖溶酶原（圖4 e-g)。
接下來，我們探討了CypA–MMP9 (proinflammatory cyclophilin A–matrixmetalloproteinase-9)通路的作用。當APOE4基因敲入小鼠的腦毛細血管周細胞激活時，CypA–MMP9通路可以介導BBB破壞，進而誘導與血源性神經毒性蛋白有關的神經元應激，引起繼發的神經元功能障礙和突觸蛋白丟失。腦組織分析結果也顯示，與APOE3攜帶者相比，APOE4攜帶者的腦毛細血管周細胞中的CypA–MMP9途徑激活顯著升高。在我們的被試中，APOE4攜帶者在具有認知障礙的情況下表現出CSF中CypA水平升高（圖4 h，i），且與CSF中sPDGFRβ升高相關（圖4 j）。APOE4攜帶者在具有認知障礙的情況下，也發現了CSF中MMP9水平升高（圖4 k），這與CSF 中CypA水平升高相關（圖4l），這表明類似于動物模型，APOE4攜帶者中CypA–MMP9的激活與周細胞損傷相關。認知功能受損和未受損的APOE4和APOE3攜帶者之間CSF中神經膠質細胞、炎性或內皮細胞損傷的標志物無差異，但APOE4攜帶者中認知受損時的神經元特異性烯醇酶（neuron-specificenolase, NSE）有所增加，證實了神經元應激與HC和PHG的萎縮有關（圖1 j，k）。
拓展圖6. APOE4和APOE3攜帶者的神經膠質細胞和炎癥反應以及內皮和神經元細胞損傷的腦脊液生物標志物比較
關于APOE基因敲入和周細胞的動物研究表明，APOE3通過低密度脂蛋白受體相關蛋白1轉錄抑制CypA，而后者又轉錄抑制MMP9。與小鼠的數據結果一致，將APOE4攜帶者及APOE3純合子來源的多能干細胞（iPSCs）誘導分化為周細胞，結果顯示APOE4攜帶者的CypA、MMP9表達量較APOE3高（圖4m，n），這表明APOE4攜帶者可通過激活CypA-MMP9通路誘發周細胞損傷，導致BBB破壞相關的認知功能障礙。
源自APOE4（ε4/ε4）的人類誘導的多能干細胞（iPSCs）的周細胞比源自APOE3（ε3/ε3）細胞的周細胞具有更高的CypA和MMP9水平（圖4m，n），表明APOE可能以特異性的方式控制人周細胞中的CypA–MMP9。
與既往研究一致，在APOE 4攜帶者中，與APOE 3純合子相比，CSF 中Aβ1-42降低，pTau水平升高；在控制CSF中sPDGFRβ水平后，這種差異仍然顯著（擴展數據圖7）�？傊�，這些發現支持了以下觀點：在APOE 4攜帶者發生認知功能障礙的早期，Aβ和tau通路獨立于BBB破壞通路發揮作用。
圖4. APOE 4攜帶者CSF中sPDGFRβ、CypA和MMP-9升高。
拓展圖7. 認知功能障礙的APOE 4攜帶者CSF中Aβ1-42水平降低和pTau水平升高。
總結： 我們已經證明BBB破壞導致APOE 4攜帶者認知功能下降，與AD病理學無關；CSF中基線水平較高的sPDGFRβ可預測APOE 4攜帶者未來的認知功能下降；APOE 4（而非APOE 3）可以激活CSF中CypA-MMP9通路，這可能進一步導致BBB破壞加速，從而引起神經元和突觸功能障礙。
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